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PCR儀對于菌落試驗的基本步驟分析

發布時間: 2021-07-25  點擊次數: 285次
   對于菌落試驗來說按照一般的步驟,可以把每個菌落挑出來進行培養提取質粒,然后質粒進行測序或者酶切驗證目的片段。但是從培養細菌到最后送測序,花費太多時間。如果說只有一個菌落去驗證,那工作量倒不是很大。但萬一有100個菌落就比較麻煩。那么我們就可以通過PCR儀進行菌落PCR篩選。
  基本步驟如下:
  1.單菌落挑取
  把LB培養基倒入排槍槽中,然后用排槍加400μL LB培養基到48孔深孔板,用鑷子拿已滅菌的小白槍頭挑取平板上的單菌落并放到48孔深孔板中,同時在48孔深孔板和相應的表單上做好記錄,注意對于藍白斑篩選的板子要挑的是白斑。挑好的48孔深孔板用封口膜蓋好并做好相應標記(日期、板號等),用針頭在封口膜打孔,把它放在37搖床上搖一個小時。
  2.菌落PCR反應
  配置好PCR反應的反應體系,把配好的反應液加到96孔反應板中,用排槍加2.5μL的菌液到其中,注意在96孔反應板上做好標記。把96孔反應板放在PCR儀上蓋好橡膠墊,按照PCR反應條件設置反應程序,注意一定要把PCR儀的蓋子蓋緊。
  3.瓊脂糖凝膠電泳
  一般先配置1.0%-1.2%瓊脂糖凝膠(即稱1.2g的瓊脂糖加100ml的TAE),在96孔反應板每個管中加0.5μL的溴酚藍,震蕩均勻,然后點樣,電泳好的瓊脂糖凝膠拍照,命名保存。
  4.判斷陽性克隆并測序
  根據瓊脂糖凝膠電泳圖條帶來判斷陽性克隆,把陽性克隆的菌液進行擴大培養,進行測序驗證,看看是否有完全正確的序列。
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